guimow 基于功能分子MoS2纳米复合材料的DNA电化学传感器研究
在我们的研究中，我们报道了二硫化钼(MoS2)纳米板负载的聚吲哚-6-羧酸(PIn6COOH)的发展及其用于循环肿瘤DNA(ctDNA)的电化学测定，如与乳腺癌相关的PIK3CA基因。用溶剂去角质法制备的二硫化钼纳米薄片首先固定在碳糊电极表面；然后，将新型电活性材料PIn6COOH通过恒电位法电聚合在MoS2底层上，形成独特的纳米复合结构。芳香族In6COOH单体与MoS2之间的物理吸附提高了电聚合效率，提高了PIn6COOH的电化学响应。由于存在大量的羧基，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺与N-氢磺丁二酰亚胺的交联反应，在端羧基的PIn6COOH/MoS2纳米复合材料上将探针ssDNA共价固定。共价固定探针ssDNA可以选择性地与目标DNA杂交，在PIn6COOH/MoS2纳米复合材料表面形成dsDNA。通过循环伏安法和电化学阻抗谱可以敏感地识别DNA固定和杂交诱导的PIn6COOH的自信号变化。所研制的生物传感器具有良好的DNA杂交性能，检测限为1.5×10-17mol/L，用于PIK3CA基因的检测。该生物传感器结构简单、灵敏度高、耗时短，使其在肿瘤诊断和治疗领域具有很强的应用前景。
1引言
循环肿瘤DNA(ctDNA)是血液中循环的游离细胞DNA片段中来自癌细胞的部分。相对于组织活检或骨髓抽吸，使用相对非侵入性的抽血来检测癌症异常是一个有吸引力的选择。通过避免与原发肿瘤取样相关的疼痛和并发症，ctDNA检测可使患者更频繁地接受检测，从而对疾病进行前瞻性管理，发现早期复发并在成功治疗后对微小残留疾病进行纵向跟踪。由于这些独特的性质，血液中的ctDNA检测可以作为液体活检的有效手段，可能在某些诊断应用中取代其他生物标志物[1-3]。然而，尽管ctDNA是一种很有前途的非侵袭性癌症评估的潜在生物标志物，但在癌症患者的血清样本中检测突变的ctDNA是非常具有挑战性的，因为ctDNA含量非常低，同时存在大量的高水平宽型DNA。因此，要成功检测突变的ctDNA，必须有一种高灵敏度和选择性的方法来检测患者样本中存在高背景水平的未突变序列时，突变的ctDNA浓度极低的情况。传统的ctDNA分析方法可以分为扩增法和基于序列的方法。虽然基于扩增和测序的方法极大地促进了ctDNA检测的发展，但由于存在很多障碍，不能作为常规的诊断工具，如耗时、成本极高、操作复杂等[4]。因此，迫切需要开发新的策略来实现对肿瘤特异性突变的高敏感性、特异性、高成本效益和快速检测。例如，Zhou等人报道了通过DNA介导的单壁碳纳米管表面增强拉曼光谱检测ctDNA[5]。Chu等人报道了基于薄层MoS2/石墨烯复合材料的ctDNA的高灵敏度电化学检测[6]。
为了获得更好的分析性能,一些传统的纳米材料，如碳纳米材料和金属纳米材料被引入，以提高电化学传感器的灵敏度，因为它们具有较大的比表面积、快速的电子转移率和丰富的结合位点[7-13]。二维(2D)二硫化钼（MoS2）是一种层状半导体材料，由共价结合的S-Mo-S层通过弱范德华相互作用叠加而成，是一种新兴但重要的无极石墨烯类似物；由于其具有高比表面积、优异的电化学催化活性、易功能化和显著的生物相容性等优点，引起了人们的广泛关注[14-16]。因此，二维MoS2是一种很有前景的电化学传感器构建材料[17-23]。例如，Qiao等人构建了一种新型电化学传感平台，用于基于核酸适配体-MoS2偶联物的心肌肌钙蛋白I的超敏检测。Dou等人开发了一种三金属杂化纳米修饰的MoS2纳米片传感器，用于直接现场监测活癌细胞分泌的H2O2[18]。Chand等人报道了用铜铁氧体纳米复合材料和分子探针固定化的MoS2纳米薄片作为电化学检测miRNA的纳米载体的合成[19]。
导电聚合物(CPs)或CPs与纳米材料的复合材料已成功地应用于DNA电化学生物传感器[24,25]。对于基于CPs的DNA电化学传感器，该聚合物不仅用作固定载体，而且在有目标分析分子存在的情况下，还发挥着信号转导的积极作用。聚吲哚-6-羧酸(PIn6COOH)作为一种非常规的CP，因其具有较高的氧化还原活性和不稳定性而备受关注；它已被用来测定生物分子[26,27]。在本研究中，我们首次报道了一种用与PIK3CA无指示电化学测定的高性能生物传感平台的创新设计，将电聚合的PIn6COOH应用于预先制备的MoS2纳米片衬底上。乳腺癌患者外周血中存在的PIK3CA基因是一种ctDNA[28]。通过PIn6COOH/MoS2纳米复合材料中丰富的羧基与探针DNA5’端自由氨基之间的共价结合，成功地实现了探针DNA的固定化，形成了电流响应降低的“信号结束”模型。在探针DNA与目标DNA杂交后，双螺旋结构的形成诱导了纳米复合材料的“信号”。
DNA/PIn6COOH/MoS2膜的构象和伴随的电导率裱花导致导PIn6COOH层的紫阳花还原信号发生明显变化。利用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱法(EIS)研究了DNA杂交无指示直接电化学测定的机理。
2材料和方法
2.1设备和材料
电化学测量在标准三电极电化学分析仪（上海仪器仪表有限公司，中国）上进行。以铂丝为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，模态碳糊电极(CPE,直径3毫米)为工作电极。透射电子显微镜(TEM)是在JEM-2100机器(JEOL、日本)上进行的。
吲哚-6-羧酸(In6COOH,99%)来自于上海阿拉丁生物科技(中国)有限公司。石墨粉(光谱纯，直径30mm)产自上海胶体化工厂。MoS2从中国天津科米化学试剂有限公司收购。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)卡二亚胺(EDC)和n-氢磺基琥珀酰亚胺(NHS)从Sigma-Aldrich公司(美国)获得。乙腈和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自上海试剂公司(中国)。所有化学药品均为分析级，未经进一步处理使用。所有DNA序列均由上海生工生物科技有限公司(中国)合成。
2.2传感接口的制作
首先将10mg的二硫化钼粉末置于10mLDMF中超声处理10h，制备去角质二硫化钼纳米薄片；然后，得到浓度为1.0mg/mL的均匀悬浮液[29]。如前所述，CPE是装配式的[30]。为了获得一个光滑的表面，CPE的表面用称重纸进行了预处理。将10ml悬浮液均匀浇铸在CPE的预处理表面，室温干燥得到MoS2/CPE。
将制备的电极(MoS2/CPE)在含0.05mol/LIn6COOH单体的乙腈中以1.4V的固定电位进行500s的电聚合，得到的电极记为PIn6COOH/MoS2、CPE。为了进行比较，同样的方法也被用于制作不含MoS2纳米片的电极，并被命名为PIn6COOH/CPE。
2.3DNA的固定和杂交
利用EDC/NHS交联反应，通过DNA探针的游离胺将ssDNA探针共价固定在PIn6COOH/MoS2/CPE表面。激活PIn6COOH/MoS2纳米复合材料的末端羧基的方法是：将含有2.0mmol/LEDC和5.0mmol/LNHS的0.3mol/LPBS(pH7.0)浸泡1小时。用PBS(pH7.0)冲洗连接剂/PIn6COOH/MoS2/CPE，洗去多余的EDC和NHS。将10微升含ssDNA探针（1.0×10-11mol/L）的PBS（PH7.0）滴于化学修饰电极上，用空白PBS缓冲液风干洗涤，去除未结合的捕获探针；该探针捕获电极为ssDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE。将探针捕获的电极浸泡在含有cDNA（1.0×10-11mol/L）的杂交缓冲液(PBS,pH7.0)中2小时，通过DNA杂交将cDNA捕获到电极上，然后用空白PBS缓冲液彻底清洗，去除未杂交的cDNA。将上述步骤应用于单碱基错配DNA（1.0×10-11mol/L）、三碱基错配DNA（1.0×10-11mol/L）和ncDNA（1.0×10-11mol/L）杂交的概率化电极。ESI方案S1展示了自信号电化学传感平台的检测过程和原理示意图。
2.4电化学测量
CV实验在电位窗0.5V~0.3V的0.3mol/LPBS(pH7.0)中进行，扫描率为100mV/s。EIS测量在0.3mol/LPBS(pH7.0)中进行，频率范围为1Hz到105Hz，交流电压幅值为5mV。在整个实验过程中，溶液中不断地通入氮气以去除任何氧气。特别说明除外，所有实验都在室温下进行。
3结果与讨论
3.1TEM表征
图1A展示出了制备的MoS2纳米薄片的TEM图像。从图中可以清楚地看到，成功地制备了相互重叠并堆积在电极表面的MoS2纳米片的层结构。二硫化钼纳米薄片是用超声法从二硫化钼粉末中分离得到的。在无二硫化钼的CPE上电聚合形成的PIn6COOH膜表面粗糙，有许多皱纹，如图1B所示。如图1C所示，合成的PIn6COOH/MoS2纳米复合材料仍然由堆叠的纳米薄片组成，但纳米薄片表面不光滑，说明在MoS2基底表面形成了PIn6COOH团聚体，导致表面粗糙。结果还表明，MoS2是一种支撑材料，为PIn6COOH的生长提供了大量的活性位点。
3.2不同电极的电化学行为
如图2所示，通过监测PIn6COOH的自氧化还原信号，研究了不同模态电极在0.3mol/LPBS(pH7.0)中的电化学行为。没有观察到裸CPE的CV峰(曲线a)。如图b所示，PIn6COOH/CPE的CV响应由一对清晰的氧化还原峰组成，这可以归因于发生在表面的电活性PIn6COOH膜的自氧化还原反应。与PIn6COOH/CPE(曲线b)相比，PIn6COOH/MoS2/CPE(曲线c)的CV值要大得多，这可能是由于以下原因：具有大尺寸表面的MoS2纳米片层为In6COOH单体提供了良好的吸附平台，大大地提高了电聚合效率，提高了PIn6COOH的电化学响应。
图1MoS2(A)、PIn6COOH(B)和PIn6COOH/MoS2(C)的TEM图像。
图2在0.3mol/LPBS(pH7.0)中分别记录裸CPE(a)、PIn6COOH/CPE(b)和PIn6COOH/MoS2/CPE(c)的代表性CVs。
3.3PIn6COOH电聚合的优化
聚苯胺的电聚合受二硫化钼纳米片用量的影响。PIn6COOH/MoS2纳米复合材料的电化学响应随着MoS2纳米薄片数量的增加而逐渐增加，在10微升的1.0mg/mLMoS2纳米薄片时达到最大响应。低浓度的二硫化钼纳米片形成了非常薄的二硫化钼薄膜；因此，MoS2薄膜与In6COOH单体的结合位点较少，导致了MoS2与In6COOH之间的物理吸附较弱。然而，当二硫化钼纳米片的浓度大于1.0/mgmL时，电化学响应会降低。这可能是由于极厚的MoS2层覆盖在电极表面，可以叠加在一起，阻止了PIn6COOH的有效吸附和电聚合。因此，在我们的实验中，我们使用了10微升的1.0mg/mL纳米片来进行电极调制。
电化学制备参数，特别是电聚合时间对聚苯胺/二硫化钼纳米复合材料的电化学性能有一定的影响。在实验中，聚合电位保持在恒定的1.4V。以PIn6COOH的自氧化还原反应为指标，优化电聚合时间。PIn6COOH/MoS2纳米复合材料的电化学信号随着电聚合时间的增加而增加，在500s时达到最大；然后，随着进一步的电聚合，信号减弱。因此，选择500s的时间作为电聚合时间。
3.4DNA固定和杂交的自信号监测
如图3所示，我们使用0.3mol/LPBS(pH7.0)中的CV对DNA固定和杂交后的PIn6-COOH/MoS2/CPE的电化学自信号进行了研究。如上所述，得到的PIn6COOH/MoS2/CPE在中性环境中表现出良好的电化学活性(曲线a)。通过共价键将氨基功能化的探针ssDNA固定在具有丰富羧基的PIn6COOH/MoS2纳米复合材料表面后，ssDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE的自氧化反应急剧下降(曲线b)。探针ssDNA表现为随机线圈，具有可能改变结构和阻止电子沿PIn6COOH链有效转移的特性[31]；这导致了ssDNA/PIn6COOH/MoS2层的响应降低(“信号关闭”)。然而，将探针ssDNA与cDNA杂交后，CV响应(曲线c,“信号启动”)较曲线b有所增加。杂交后的电流增强可能是由于DNA构象的改变。事实上，ssDNA表现为随机线圈，而dsDNA则导致了一个更有组织的表面，通过这个表面，沿着双螺旋结构的反离子可以更自由地扩散。同时，ssDNA为可溶分子，dsDNA为刚性杆；因此，沿双螺旋结构的电子传递速率比沿单链结构的要快得多[32,33]。因此，ssDNA探针与cDNA杂交后，自氧化还原信号增加(“信号启动”)。上述结果表明，PIn6COOH层的自氧化还原信号变化可以作为CV法直接测定DNA的一种简单有效的工具，不需要任何外部指标，也不需要在DNA探针或靶分子上添加任何标签。
图3在0.3mol/LPBS(pH7.0)中分别记录到PIn6COOH/MoS2/CPE(a)、ssDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE(b)和dsDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE(c)的代表性CVs。
3.5所研制的DNA生物传感器的特异性
为了评价所研制的生物传感器的特异性，在0.3mol/LPBS(pH7.0)中检测了靶DNA、单碱基错配DNA、三碱基错配DNA和ncDNA等不同的非特异性干扰DNA序列，结果如图4所示。曲线a表示PIn6COOH/MoS2/CPE的Bode图。从曲线f可以看出，当探针ssDNA与PIn6COOH/MoS2纳米复合材料共价结合时，阻抗响应增加，这明显表明探针ssDNA固定化成功。与目标DNA杂交后，阻抗明显下降(曲线b)，EIS结果与上述CV结果一致。单碱基错配的DNA(曲线c)和三碱基错配的DNA(曲线d)的阻抗比曲线b大，说明由于碱基错配，未实现完全杂交。从曲线e中可以看出，与ncDNA杂交时，阻抗响应与曲线f相比变化不大，说明几乎没有杂交发生。这些结果表明，基于PIn6COOH/MoS2纳米复合材料构建的无指标DNA生物传感器对其互补目标DNA具有较高的特异性。
图4分别记录了PIn6COOH/MoS2/CPE(a)、ssDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE(f)、dsDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE的代表性Bode图(与cDNA杂交，(b))，与单碱基错配的DNA杂交(c)，与三碱基错配的DNA杂交(d)，与ncDNA(e)在0.3mol/LPBS(ph7.0)中杂交
3.6生物传感器的分析性能
在最佳实验条件下，将所提出的探针ssDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE与一系列浓度的靶DNA孵育，得到的Bode图如图5A所示。当目标DNA浓度从1.0×10-16mol/L到1.0×10-11mol/L。以探针电极与cDNA杂交前后的logZ值(频率范围为105hz)之差(ΔlogZ)作为参考测量信号。图5B为ΔlogZ值与目标序列的对数之间的线性关系和目标序列浓度的线性回归方程为ΔlogZ=0.0691logC+1.2134和回归系数(R)为0.9968。检出限为1.5×10-17mol/L(基于S/N=3)。
图5(A)ssDNA/PIn6COOH/MoS2/CPE(A)与不同浓度PIK3CA基因靶序列杂交后的代表性Bode图:(b)1.0×10-16,(c)1.0×10-15,(d)1.0×10-14,(e)1.0×10-13,(f)1.0×10-12和(g)1.0×10-11mol/L在0.3mol/L的PBS中（PH7.0）。(B)DlogZ与PIK3CA基因目标序列浓度的对数的关系图。
3.7DNA生物传感器的稳定性和重复性
对所研制的DNA生物传感器的稳定性我们进行了研究。将制备好的DNA生物传感器在相同条件下4℃PBS(pH7.0)中保存3周后，进行DNA生物传感器检测记录阻抗响应。与初始值相比，该信号仍保持在93.8%，说明该生物传感器在三周内表现出良好的稳定性。
DNA杂交识别平台的重复性在DNA分析中也尤为重要。采用6个平行制备的探针电极检测1.0×10-16mol/L一个相对标准偏差为5.33%的目标DNA序列，表示这个生物传感器对目标DNA的检测具有可接受的重复性。
4结论
综上所述，首次提出了一种方便检测乳腺癌相关PIK3CA基因的高灵敏度电化学检测策略。以PIn6COOH功能化的MoS2纳米片为信号转导材料，实现了敏感检测。该生物传感器具有检测限低、线性范围宽、特异性强、重现性好、稳定性好等特点。我们认为，所设计的生物传感器可以作为敏感检测生物样本DNA的一个有前途的候选，并可能用于乳腺癌的早期临床诊断和治疗。
